5-氨基乙酰丙酸（ALA）是一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，能通過(guò)調(diào)節(jié)光合、抗氧化、離子轉(zhuǎn)運(yùn)等機(jī)制來(lái)提升植物抗逆性。前期研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下使用外源ALA能夠促進(jìn)植物根系將所吸收的Na+截留于地下部，減少向地上運(yùn)輸，緩解鹽離子對(duì)光合器官傷害，但ALA對(duì)Cl−毒性的緩解機(jī)制卻了解不深。眾所周知，過(guò)量Cl−會(huì)導(dǎo)致植物葉綠素降解，破壞氮素穩(wěn)態(tài)，嚴(yán)重時(shí)引發(fā)細(xì)胞程序性死亡。這是引起植物鹽害的重要原因。本文證明，ALA誘導(dǎo)上調(diào)的蘋(píng)果蛋白磷酸酶2A（PP2A）能夠促進(jìn)MdCLC脫磷酸化，促進(jìn)Cl−積累于根系液泡，減少其向地上部運(yùn)輸，從而提高植物耐鹽性。
1. ALA增強(qiáng)蘋(píng)果耐鹽性并特異性誘導(dǎo)MdPP2AC表達(dá)
鹽脅迫下，ALA預(yù)處理可顯著緩解蘋(píng)果無(wú)根苗葉片褐化，緩解葉綠素含量下降；NaCl可誘導(dǎo)PP2A酶活性上升，ALA進(jìn)一步強(qiáng)化該效應(yīng)。在MdPP2AC家族中，只有基因ID為L(zhǎng)OC103451899的MdPP2AC受到鹽脅迫和ALA共同上調(diào)，啟動(dòng)子活性也被二者共同激活，提示 MdPP2AC可能是ALA誘導(dǎo)蘋(píng)果耐鹽性的重要候選基因。
圖1 ALA增強(qiáng)蘋(píng)果耐鹽性及MdPP2AC表達(dá)響應(yīng)
2. MdPP2AC是ALA誘導(dǎo)蘋(píng)果耐鹽性的正調(diào)控因子
過(guò)表達(dá)MdPP2AC（OE）可顯著提升蘋(píng)果葉片耐鹽性，減少鹽脅迫導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，維持葉綠素含量，增強(qiáng)SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性，抑制H2O2 、O2•¯ 及MDA積累，促進(jìn)脯氨酸合成；PP2A特異性抑制劑（CT）則加劇鹽損傷，而ALA可緩解CT的抑制效應(yīng)。這些證據(jù)顯示，MdPP2AC是ALA誘導(dǎo)蘋(píng)果耐鹽通路的關(guān)鍵下游因子。
圖2 MdPP2AC介導(dǎo) ALA 促進(jìn)蘋(píng)果愈傷組織耐鹽性
3. MdPP2AC介導(dǎo) ALA 促進(jìn)蘋(píng)果愈傷組織耐鹽性
在正常生長(zhǎng)條件下，野\生型（WT）、OE-MdPP2AC及 RNAi-MdPP2AC蘋(píng)果愈傷組織生長(zhǎng)沒(méi)有顯著差異；而在鹽脅迫條件下，OE-MdPP2AC 愈傷組織的鮮重顯著高于 WT 和 RNAi，抗氧化酶活性增強(qiáng)，O2•¯和 MDA 積累減少，同時(shí)Cl−含量顯著升高。進(jìn)一步添加外源ALA，則OE-MdPP2AC細(xì)胞系上述生理響應(yīng)被進(jìn)一步增強(qiáng)，但RNAi-MdPP2AC明顯削弱ALA的促進(jìn)效應(yīng)。這些結(jié)果說(shuō)明，MdPP2AC促進(jìn)蘋(píng)果細(xì)胞內(nèi)Cl−積累與氧化還原穩(wěn)態(tài)，在ALA增強(qiáng)蘋(píng)果愈傷組織耐鹽性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
圖3 MdPP2AC對(duì)蘋(píng)果愈傷組織耐鹽性的影響
4. MdPP2AC促進(jìn)根部 Cl−截留并減少向地上部運(yùn)輸
鹽脅迫下，OE-MdPP2AC 生根苗葉片褐化程度更輕，葉綠素含量和相對(duì)含水量更高，抗氧化能力更強(qiáng)；OE 株系根部Cl−含量顯著升高，葉片Cl−含量降低，CT 處理則相反，ALA 可逆轉(zhuǎn) CT 的影響。MQAE 熒光探針檢測(cè)證實(shí)，OE-MdPP2AC促進(jìn)根系成熟區(qū)Cl−積累，ALA 進(jìn)一步增強(qiáng)該效應(yīng)，表明 ALA誘導(dǎo)的MdPP2AC能夠促進(jìn)Cl−截留于根系成熟區(qū)以維持植株氯離子穩(wěn)態(tài)。
圖4 MdPP2AC調(diào)控蘋(píng)果根部Cl−分布及耐鹽性
5. 蘋(píng)果全基因組MdCLC成員鑒定及其對(duì)NaCl和ALA的響應(yīng)
Cl−跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和區(qū)室化由氯離子通道蛋白（CLC）介導(dǎo)。在蘋(píng)果基因組中，存在著11個(gè)MdCLC家族成員，可分為6個(gè)亞家族（標(biāo)記為b-g），其中 MdCLC-b1/c1/c2/d1的表達(dá)受 MdPP2AC 和 ALA 上調(diào)，提示這些基因可能參與 MdPP2AC 介導(dǎo)的 ALA 誘導(dǎo)蘋(píng)果耐鹽通路。
圖5 MdCLC基因家族成員的全基因組鑒定及其對(duì)NaCl和ALA處理的響應(yīng)
6. MdPP2AC 與液泡膜蛋白 MdCLC-c2 互作
酵母雙雜交（Y2H）、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）和螢火蟲(chóng)熒光素酶互補(bǔ)（LCI）實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MdPP2AC 可與 MdCLC-c2 直接互作，與 MdCLC-b1 弱互作，不與 MdCLC-c1 互作。亞細(xì)胞定位顯示，MdCLC-c2 與液泡膜標(biāo)記蛋白 RFP-VAC 共定位，確認(rèn)為液泡膜蛋白。
圖6 MdPP2AC 與 MdCLC-c2 互作驗(yàn)證及定位
7. MdCLC-c2 的 C 端 Glu684殘基是互作關(guān)鍵位點(diǎn)
AlphaFold 預(yù)測(cè)顯示 MdPP2AC 與 MdCLC-c2 的 C 端 CBS 結(jié)構(gòu)域互作；截短實(shí)驗(yàn)表明，MdCLC-c2 的 aa488-539和 aa540-758區(qū)域是互作必需的。點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Glu684→Ala可完全阻斷二者互作，表明 Glu684是 MdPP2AC 與 MdCLC-c2 互作的核心殘基。
圖7 MdPP2AC 與 MdCLC-c2 互作關(guān)鍵位點(diǎn)鑒定
8. MdPP2AC 與 MdCLC-c2 協(xié)同 ALA 增強(qiáng)酵母耐鹽性
酵母Δgef1突變體對(duì)鹽敏感，異源表達(dá)MdCLC-c2可部分恢復(fù)耐鹽性，共表達(dá)MdPP2AC則顯著增強(qiáng)該效應(yīng)，ALA處理進(jìn)一步提升耐鹽性。胞內(nèi)Cl−含量檢測(cè)顯示，MdCLC-c2 可促進(jìn) Cl−積累，MdPP2AC和ALA協(xié)同強(qiáng)化該過(guò)程。以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)，二者通過(guò)調(diào)控Cl−轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)細(xì)胞耐鹽性。
綜上所述，鹽脅迫可誘導(dǎo)MdPP2AC和MdCLC-c2表達(dá)，但二者單獨(dú)作用時(shí)Cl−轉(zhuǎn)運(yùn)活力依然有限，根系Cl−向地上部運(yùn)輸，引發(fā)離子毒害和氧化損傷。外源使用ALA能顯著促進(jìn)MdPP2AC與MdCLC-c2表達(dá)，促進(jìn)兩種蛋白在依賴(lài)MdCLC-c2的C端Glu684殘基存在基礎(chǔ)上發(fā)生物理互作，可能通過(guò)脫磷酸化作用來(lái)激活Cl−通道功能，將大量Cl−截留于根細(xì)胞液泡，減少向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)；同時(shí)增強(qiáng)SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性，清除活性氧自由基，協(xié)同維持離子與氧化穩(wěn)態(tài)。因此，蘋(píng)果植株耐鹽性得到改善。
本研究揭示了“PP2AC-CLC”介導(dǎo)ALA耐鹽的全新分子機(jī)制，明確了關(guān)鍵互作位點(diǎn)，為蘋(píng)果耐鹽分子育種提供了靶點(diǎn)，也為ALA在鹽堿地果園的綠色應(yīng)用提供了新的理論支撐。
